Citotoxicidad

 

Para llevar a cabo los ensayos de citotoxicidad se partió de los cultivos celulares de mantenimiento, a una concentración de 1 millón de células viables/ml, almacenadas en botellas estériles de cultivo in vivo con 10 ml de medio líquido RPMI a 37 ºC y a una atmósfera del 5 % de CO2.

 

Para llevar a cabo el ensayo, se utilizan placas multipocillos, con 96 pocillos, en los cuales se deposita un volumen final de 200 µl de las respectivas soluciones de las sustancias a ensayar, junto con el volumen celular correspondiente a la cantidad de 20000 células. Así mismo, se realizó un control negativo con medio RPMI.

 

Tanto para cada una de las concentraciones como para el control con medio RPMI, se realizaron tres réplicas independientes. Los resultados fueron leídos tras 72 horas de incubación, valorando la viabilidad celular mediante el método de exclusión con azul tripán. 

 

 

Análisis estadístico

 

Los resultados obtenidos se han representado gráficamente, utilizando la media de tres experimentos independientes, en primer lugar se representan las células viables y en segundo lugar las células no viables, siguiendo a continuación su discusión.

 

Para obtener las curvas de inhibición tumoral se ha obtenido en primer lugar la curva de crecimiento relativo, es decir, células viables del tratamiento respecto a células viables del control tomando como datos representativos de las 72 horas. También se ha determinado el error típico de los tres experimentos y se añade la curva de ajuste que proporciona el programa Excel. Si hay curva dosis respuesta se calcula la concentración inhibitoria 50 (CI50) que es la que inhibe el crecimiento al 50%.

 

 

 

Fragmentación

 

Este procedimiento nos ayuda a conocer si la vía de muerte celular que ha inducido la citotoxicidad ha sido la apoptótica. Seguimos el método desarrollado por Merinas-Amo y colaboradores (2013):

 

Se incuban 1 millón cel/ml en placas de cultivo de 12 pocillos y las tratamos con nuestros compuestos y sus diluciones correspondientes. Utilizamos una botella de cultivo para cada compuesto con su correspondiente control con medio RMPI. Centrifugamos durante 5 minutos a 5000 rpm, eliminamos el sobrenadante y resuspendemos el pellet con 1.5 ml de las diluciones de nuestros compuestos a ensayar. Los controles serán resuspendidos con medio RPMI. Se incuban en las placas de 12 pocillos durante 5 horas en la cámara de cultivos de células. Se centrifuga todo lo sembrado durante 5 minutos a 3000 rpm, se tira el sobrenadante con cuidado y le añadimos 900 µl de tampón de lisis resuspendiendo el pellet; 100 µl de SDS (1 g/10ml) y 25 µl de proteinasa K (20 mg/ml) y se incuba durante 5 horas a 55 ºC a 350 rpm en termobloque. Homogenizamos con 432 µl de NaCl 5 M y se alícuota todo en nuevos eppendorf sin recoger espuma. Se centrifuga a 13000 rpm durante 15 minutos. Recogemos 750 µl del sobrenadante y le añadimos 750 µl de isopropanol (1:1) y mezclamos por inversión suavemente. Centrifugamos 10 minutos a 13000 rpm y tiramos el sobrenadante. Resuspendemos el pellet en etanol 70 % con 1 ml para soltar el pellet y se centrifuga de nuevo a 13000 rpm. Se decanta el sobrenadante y se deja secar. Se añade 20 µl de agua milliQ y 0.6 µl de ARNasa working y se deja incubar a 37 ºC y 300 rpm toda la noche.

 

Posteriormente se cuantifican las muestras en espectrofotómetro (Nanodrop) y cargamos en gel de agarosa al 2% la cantidad de 1200 ng de ADN. Se realiza la electroforesis y se visualiza el gel bajo luz ultravioleta.