Prueba SMART: genotoxicidad y antigenotoxicidad

 

Los ensayos de genotoxicidad y antigenotoxicidad se llevan a cabo siguiendo el procedimiento de Graf et al., (1984 y 1998 respectivamente) modificado por nuestro departamento.

 

Para los ensayos de genotoxicidad utilizamos las diluciones de nuestro compuesto a estudiar y un control negativo con agua destilada. En este ensayo determinamos la capacidad mutagénica del compuesto estudiado.

 

Por otro lado, en el ensayo de antigenotoxicidad, utilizamos también las mismas diluciones y como control negativo agua destilada, además de un control positivo en el que se usa agua y 50µl de peróxido de hidrógeno. Usamos H2O2 0.15M como genotoxina (Anter et al., 2010). En este ensayo se determinará la capacidad preventiva del compuesto frente a mutágenos.

 

En ambos ensayos se observa el fenotipo, número y forma de los pelos por célula presente en el ala siguiendo la prueba SMART:

 

Para el análisis de actividad genotóxica y antigenotóxica se han usado los individuos transheterocigotos resultantes de los cruzamientos del ensayo de mutación y recombinación somáticas (SMART) en alas de Drosophila melanogaster.

En los ensayos SMART se analiza la pérdida de heterocigosidad, como consecuencia de alteraciones genéticas producidas en células somáticas en división expuestas a la sustancia a ensayar. En el caso del ensayo de alas, la población celular que responde a la exposición es la que forma el disco imaginal del ala en las larvas de Drosophila melanogaster. Las divisiones mitóticas en el disco del ala comienzan a partir de las 24 horas de la formación del huevo y continuará hasta la formación de la pupa (Würgler y Vogel, 1986). Las alteraciones genéticas inducidas en las células larvarias se detectan, después de la expansión clonal y metamorfosis, como grupos de células mutantes en los pelos o tricomas del ala de la mosca adulta.

 

El ensayo de mutación y recombinación somáticas en el ala, utiliza dos marcadores que afectan al fenotipo de las células del ala: mwh y flr3 y  ha demostrado su capacidad de detectar mutaciones puntuales, deleciones, ciertos tipos de aberraciones cromosómicas y recombinación mitótica.

 

La actividad recombinogénica detectable en el ensayo SMART en alas es cuantificable, analizando las alas de las moscas heterocigotas mwh/TM3, Bds. En estas moscas, la inversión múltiple TM3 impide los procesos de recombinación en la región afectada y por lo tanto, las manchas detectadas se producen exclusivamente por mutación.

En nuestros estudios realizamos tratamientos crónicos con larvas de 3 días. Por lo tanto, el tiempo de exposición de las células imaginales al compuesto es de 48 horas. Dicho tratamiento es el recomendado para el análisis de compuestos de actividad genotóxica desconocida (Graf et al., 1989). El periodo de tratamiento comprende aproximadamente las 5 ó 6 últimas rondas de división en las células imaginales alares lo que representa más del 95 % de todas las divisiones mitóticas individuales en el desarrollo del ala (Frel y Würgler, 1988).

 

Una vez tratadas las larvas con el compuesto a diferentes concentraciones, se recogen a los 12 días los adultos nacidos y se guardan en etanol al 70 %. 

 

 

Montaje de alas

 

Las moscas almacenadas en etanol al 70 %, se analizan bajo la lupa para separar las de fenotipo salvaje (correspondientes al genotipo mwh/flr3) y clasificarlas en machos y hembras. El resto de las moscas tratadas (mwh/BdS) se identifican fácilmente por el carácter aserrado (Beaded-Serrate) de las alas y únicamente se analizan cuando se quiere cuantificar la proporción de actividad genotóxica debida a recombinación (Zordan et al., 1991; Graf et al., 1992b). La proporción de manchas cuyo origen no es debido a recombinación se obtiene dividiendo la frecuencia de manchas mwh en las larvas mwh/BdS (originadas únicamente por mutaciones puntuales, ya que la inversión TM3 impide la recombinación) entre la obtenida en larvas mwh/flr3 (originadas por mutación puntual o recombinación).

 

Antes de proceder a la preparación de las alas, las moscas almacenadas se lavan en agua destilada para retirar los restos de etanol. Después, se embeben en solución Faure y, con unas pinzas muy finas, se separan las alas, que se colocan alineadas sobre un porta.

 

Cuando se completan los portas (con unas 40 alas cada uno), se dejan secar, al menos 24 horas, en una atmósfera libre de polvo. Entonces se deja caer una pequeña gota de solución Faure sobre las alas y se coloca encima un cubreobjetos sobre el que se colocan unas pesas de entre 250 y 500 gramos. La preparación se deja así unas 24 horas, para permitir que se seque por completo y quede perfectamente fijada. Se pueden entonces sellar los bordes con esmalte y la preparación quede lista para su examen.

 

Para obtener datos en la genotoxicidad y antigenotoxicidad recurrimos al análisis microscópico de las alas de la prueba SMART. El ala de Drosophila melanogaster se compone de dos capas de células, dorsal y ventral y en total 52000 pelos por ala (Alonso-Moraga y Graf., 1989). En las moscas de fenotipo salvaje, cada una de estas células emite un único pelo o tricoma.

 

 

Análisis estadístico

 

El análisis de las alas se realiza bajo un microscopio a 400 aumentos y consiste en localizar clones o células individuales que manifiesten fenotipo mutante mwh ó flr3, sobre el fondo de células de fenotipo salvaje. Para cada clon encontrado, se registra el tamaño y el sector del ala en el que se encuentra. Los sectores tenidos en cuenta del ala son: A, B, C’, C, D’, D y E (Graf et al., 1984).

 

Los tipos de manchas o clones que se pueden encontrar son:

 

• Manchas simples mwh, formadas por células con 3 o más pelos cada una. Se considera un clon mwh aquel formado por células con múltiples pelos, en el que al menos una de ellas tiene 3 pelos o más, aunque también contenga células con 2 únicos pelos. Se consideran manchas diferentes aquellas separadas por 3 o más células salvajes. Las alteraciones genéticas que pueden dar lugar al fenotipo mwh son; mutación puntual, delección, recombinación mitótica entre los loci mwh y flr, o no disyuncion.

• Manchas simples flr3 formadas por células de fenotipo flare. Dicho fenotipo se pone de manifiesto principalmente por una mutación puntual o delección en el alelo salvaje para este locus.

• Manchas genemas, formadas por células adyacentes de fenotipo mwh y flr3, respectivamente. Se originan exclusivamente por recombinación mitótica entre el locus flr y el centrómero.

 

Las manchas grandes presentan una forma alargada, longitudinal al eje del ala, indicando la dirección principal de crecimiento (García-Bellido y Merriam, 1971), y son generalmente continuas. A veces, entre las células mutantes aparecen grupos de células salvajes, debido posiblemente a una separación de las células de un clon en desarrollo por presiones interiores del tejido o movimientos de células independientes. Como criterio, se consideran 2 manchas independientes aquellas separados por 3 o más filas de células salvajes.

 

Las manchas gemelas y las simples muy grandes son muy poco frecuentes en las alas de moscas no tratadas. 

 

Ya que la última o penúltima ronda de división ocurre dentro de la pupa (Postlethwait, 1978), cuando ha cesado la ingestión de alimento, es útil distinguir entre los clones inducidos en la pupa (los más pequeños) y los inducidos en etapas más tempranas del desarrollo (los más grandes). Así, la distinción de las manchas simples entre las de 3 o más células, y las pequeñas (1 o 2 células), separa las poblaciones celulares diana expuestas durante o después de la ingestión del compuesto (Frei y Würgler, 1988). Esta delimitación no es exacta, debido a posibles variaciones en el desarrollo, diferencias en las propiedades de los compuestos (ingestión, transporte, bioactivación, estabilidad, persistencia, etc.) o incluso, porque ciertos clones pueden tender a permanecer pequeños (Graf et al., 1984).

 

La evaluación de los datos se realiza conforme a un proceso de decisión múltiple descrito por Frei y Würgler (1988-1995). En él, las frecuencias de cada tipo de clon mutante por ala se comparan con su control negativo correspondiente empleando la prueba binomial Kastenbaum-Bowman con niveles de significación α = β = 0.05. Los resultados inconcluyentes y positivos se analizan posteriormente con la prueba no paramétrica U de Mann, Whitney y Wilcoxon (α = β = 0.05). La prueba U tiene en cuenta el rango de valores en los controles y en los tratamientos (Vicedo-Jacociunas et al., 2010).

 

Los porcentajes de inhibición (PI) para los tratamientos combinados se calculan a partir del total de manchas por ala, con la siguiente fórmula (Abraham, 1994):

 

PI = (genotoxina - tratamiento combinado) / genotoxina  * 100